DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase, 縮寫DNMT）的作用下，在 DNA 鏈中的一個(gè)堿基上添加一個(gè)甲基基團(tuán)，是一種關(guān)鍵的表觀遺傳修飾。在哺乳動(dòng)物中，DNA 甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶堿基的第五個(gè)碳原子上，形成 5-甲基胞嘧啶或 5-甲基胞嘧啶核苷 (5-mC)。DNA 甲基化幾乎只存在于 CpG 二核苷酸上，是一個(gè)關(guān)鍵的表觀遺傳標(biāo)記和基因表達(dá)調(diào)控因子。DNA 甲基化過程在一些生物學(xué)現(xiàn)象中起重要作用，例如在高等真核生物中，DNA 甲基化參與調(diào)控染色體穩(wěn)定性、印記、X 染色體失活和癌變等多個(gè)細(xì)胞過程，是生物體重要的表觀調(diào)控機(jī)制之一。
全基因組DNA甲基化測(cè)序（Whole-genome bisulfite sequencing，WGBS），其原理是用重亞硫酸鹽(Bisulfite) 處理DNA序列，首先將基因組中未發(fā)生甲基化的 C 堿基轉(zhuǎn)換成 U，從而與原本具有甲基化修飾的堿基C區(qū)分開來，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，可獲得全基因組范圍內(nèi)單堿基分辨率的所有DNA甲基化情況，信息最為豐富、全面，繪制全基因組范圍內(nèi)繪制單堿基分辨率的DNA 甲基化圖譜。
應(yīng)用方向
干細(xì)胞分化：干細(xì)胞，無論是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞還是胚胎干細(xì)胞，都具有非常相似的DNA甲基化修飾特征，干細(xì)胞在分化過程中可能存在表觀基因組轉(zhuǎn)化，而不是遺傳轉(zhuǎn)化。
發(fā)育生物學(xué)：在原生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育的整個(gè)過程中，DNA甲基化模式會(huì)發(fā)生全基因組范圍內(nèi)的重排。DNA甲基化模式改變能引包括染色體狀態(tài)改變?cè)趦?nèi)的一系列變化，進(jìn)而決定細(xì)胞分化的方向。維持正常的DNA甲基化模式和甲基化水平,是胚胎正常發(fā)育以及組織特異性分化所必需的。
疾病診斷： WGBS用于檢測(cè)相關(guān)基因的異常甲基化 比如腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島被高度甲基化，抑制了抑癌基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，如急性早幼粒細(xì)胞白血病、胃癌等。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1. 測(cè)精度高，單堿基分辨率，精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)
2. 檢測(cè)范圍廣，實(shí)現(xiàn)全基因組水平上甲基化研究
3. 先進(jìn)的測(cè)序平臺(tái)，采用DNBSEQ-T7測(cè)序平臺(tái)，結(jié)果更可靠
4. 一站式服務(wù)，提供樣品處理、建庫、測(cè)序和分析的全套服務(wù)，更可以提供多組學(xué)聯(lián)合分析
技術(shù)流程
圖1 WGBS實(shí)驗(yàn)流程
送樣建議
樣本來源：人、大鼠和小鼠（其他樣本類型請(qǐng)咨詢）
新鮮或凍存組織樣本1 -2g
新鮮或凍存細(xì)胞系樣本≥10^7個(gè)cell
DNA總量≥6μg，濃度≥50ng/μL
結(jié)果展示
圖2 甲基化C 位點(diǎn)比例分布圖
(不同顏色代表不同context 下甲基化C 位點(diǎn)，各部分面積的大小代表相應(yīng)context 下甲基化C 位點(diǎn)的比例)
圖3 甲基化位點(diǎn)在基因組上的分布
（不同顏色折線代表以10 kb為窗口，窗口內(nèi)不同甲基化胞嘧啶占該類型胞嘧啶的比例）
圖4 差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因的KEGG通路分析
經(jīng)典案例：Pilocytic astrocytoma demethylation and transcriptional landscapes link bZIP transcription factors to immune response[1].
背景
上皮星形細(xì)胞瘤（PA）是最常見的小兒腦腫瘤。盡管已有研究者對(duì)基因組和轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行了充分的研究，但仍缺乏完整的甲基化組，腫瘤細(xì)胞組成和免疫浸潤(rùn)的數(shù)據(jù)和研究進(jìn)展。
方法
研究者對(duì) 9個(gè)PA 和16個(gè)對(duì)照樣品進(jìn)行了全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序 (WGBS) 和分析，并整合數(shù)據(jù)庫的154個(gè)PA和57個(gè)對(duì)照甲基化芯片數(shù)據(jù)。同樣地，也對(duì) 49個(gè)PA和11個(gè)對(duì)照樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
結(jié)論
WGBS數(shù)據(jù)的分析顯示，與對(duì)照組織相比，PA組織中有9381個(gè)顯著差異的甲基化區(qū)域（DMR），且DMR的motif分析發(fā)現(xiàn)，這些DMR受到五個(gè)不同的TF家族的增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄因子（TF）調(diào)控。甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的反卷積分析表明，與正常組織相比，PA中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)具有顯著變化。轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)分析表明， bZIP轉(zhuǎn)錄因子與參與免疫相關(guān)過程的基因之間存在調(diào)控關(guān)系。作者為甲基化差異、基因表達(dá)差異與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系提供了關(guān)鍵證據(jù)。
圖5 腫瘤低甲基化區(qū)域富含增強(qiáng)子和 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)
參考文獻(xiàn)：Aichmüller, C.F., et al., Pilocytic astrocytoma demethylation and transcriptional landscapes link bZIP transcription factors to immune response. Neuro-Oncology, 2020. 22(9): p. 1327-1338.
